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蘇州創(chuàng)譜教您液相色譜儀使用遇到的問題及對(duì)策

更新時(shí)間:2024-11-28  |  點(diǎn)擊率:2745

1液相色譜儀的基本工作原理

液相色譜儀是由溶液貯器、高壓泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離柱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)幾部分組成。高壓泵從溶液貯器中抽走流動(dòng)相,流經(jīng)整個(gè)儀器系統(tǒng),形成密閉的液體流路。樣品通過進(jìn)樣系統(tǒng)注入色譜分離柱,在柱內(nèi)進(jìn)行分離。柱流出液進(jìn)入檢測器,使已被分離的組分逐一被檢測器收集,并將響應(yīng)值轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)后經(jīng)放大被數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜峰,通過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對(duì)記錄的峰值進(jìn)行存儲(chǔ)和計(jì)算。

2輸液泵的常見故障及對(duì)策

輸液泵/高壓泵是保證HPLC系統(tǒng)流路暢通、流量和壓力穩(wěn)定的重要儀器部件,目前多用往復(fù)式恒流柱塞泵,主要由柱塞桿、密封墊圈和兩個(gè)單向閥組成,用馬達(dá)帶動(dòng)凸輪驅(qū)動(dòng)柱塞桿作吸液和排液的往復(fù)運(yùn)動(dòng)。常分為單柱塞泵、并聯(lián)柱塞泵、串聯(lián)柱塞泵和柱塞隔膜泵等類型。流動(dòng)相混合方式分為低壓混合和高壓混合。常見泵的故障主要有以下幾種,并提供解決的辦法。

2.1單向閥故障

 由于球與閥座密封不嚴(yán),液體倒流,造成壓力不穩(wěn),甚至球與閥座粘在一起阻死。密封不嚴(yán)

主要是污染或氣泡引起,球與閥座粘連也是由于污染和磨損造成。為避免單向閥中的寶石球和閥座被污染,流動(dòng)相應(yīng)使用HPLC級(jí)的溶劑,并且配好的流動(dòng)相一定要用0.45u濾膜過濾和脫氣。如果泵被微粒污染,可分別用水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷依次沖洗。沖洗時(shí)應(yīng)打開泄液閥,zui后再用所用的溶液沖洗整個(gè)系統(tǒng)。氣泡進(jìn)入閥中會(huì)緊貼在閥體的一側(cè),使寶石球難返回到閥座,引起倒流,泵的壓力和流速會(huì)明顯改變。此時(shí),應(yīng)立即打開泄液閥,大流量(2ml/min)沖洗泵,直至排除液為直線型。因?yàn)榧状伎蓾櫇癖脙?nèi)壁,擠出氣泡,故也可使用脫過氣的甲醇沖洗泵。長期不用的泵或新裝的泵頭應(yīng)該用甲醇趕氣泡。泵進(jìn)氣泡也可在泵頭上排氣泡,即用扳手固定住進(jìn)氣泡的泵頭,擰開輸出管道的壓帽,手動(dòng)泵送液,可見到氣泡從孔中擠壓出來,直至無氣泡排出將壓帽擰緊

[3]采取上述辦法仍不能使壓力穩(wěn)定,應(yīng)考慮是否密封墊壞了?或單向閥磨損、球不光滑等,需更換部件。

2.2泵墊圈故障泵墊圈常見的故障是滲漏和墊圈受損污染系統(tǒng)。

液相色譜系統(tǒng)一般情況下不要使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液,因?yàn)檫@會(huì)損壞密封墊和柱塞桿。密封墊圈與運(yùn)動(dòng)著的柱塞桿緊密接觸,可使柱塞在泵頭自由運(yùn)動(dòng)而流動(dòng)相不漏出來,它是液相色譜系統(tǒng)中zui易磨損的部件。有條件的實(shí)驗(yàn)室可三個(gè)月更換一次墊圈,防止泵系統(tǒng)污染。如果用緩沖鹽作流動(dòng)相則更會(huì)加速墊圈的磨損,應(yīng)及時(shí)沖洗。當(dāng)墊圈損壞時(shí),表現(xiàn)為:泵壓力不穩(wěn)、泵頭漏液。一旦出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象,應(yīng)盡快更換新墊圈。

為避免上述故障的發(fā)生,我們?cè)诜治龉ぷ髦袘?yīng)注意以下幾點(diǎn):

①使用超純水(18MΩcm)、純度級(jí)別較高的試劑和色譜級(jí)溶劑配制流動(dòng)相;

②配好的流動(dòng)相一定要抽濾脫氣,即便儀器有在線脫氣裝置,也在上機(jī)前進(jìn)行抽濾。真空抽濾既過濾顆粒也脫了氣泡,非常有效。

③泵在起動(dòng)前一定要通過泄液閥抽凈泵里的空氣。

④用緩沖鹽洗脫時(shí),分析結(jié)束后一定要用水沖洗泵和整個(gè)流路系統(tǒng),不要讓腐蝕性溶液滯留泵中,zui后用有機(jī)溶劑充滿系統(tǒng)。

3.色譜分離柱的使用與維護(hù)在前述儀器工作原理部分,我們已經(jīng)指出,液相色譜儀的分離是在色譜分離柱中實(shí)現(xiàn)的。我們目前工作中多采用反相色譜柱,如何保護(hù)好分離柱減少柱的污染是延長柱壽命的關(guān)鍵。

3.1怎樣維護(hù)好色譜分離柱加保護(hù)柱(預(yù)柱)是保護(hù)分離柱的有效辦法。保護(hù)柱是根內(nèi)裝填料與分離柱性質(zhì)相近的短柱,接在分離柱之前,或代替流路過濾器。保護(hù)柱的作用是收集和阻塞分離柱口的化學(xué)垃圾,這些垃圾如果直接進(jìn)入分離柱會(huì)逐漸堆積在柱頭,zui終降低柱效能。保護(hù)柱是消耗品,如分析血漿樣品,一般分析50個(gè)樣品后需更換新柱芯。避免高壓沖擊分離柱。一般色譜柱都能承受得起高壓,但經(jīng)不住突然變化的高壓沖擊,這將改變柱床體積,影響柱效。引起高壓沖擊的原因主要有:進(jìn)樣器的樣品閥的緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)、泵啟動(dòng)太快、柱切換等操作。用手動(dòng)進(jìn)樣閥時(shí)的壓力變化不大,自動(dòng)進(jìn)樣閥由于切換較慢,可能會(huì)造成壓力沖擊。
合理選擇分離柱。我們知道,選擇色譜分離柱主要根據(jù)兩點(diǎn),一是根據(jù)待測組分的分子量的大?。欢歉鶕?jù)流動(dòng)相條件,包括PH值、離子強(qiáng)度和溶劑極性等。傳統(tǒng)硅膠基質(zhì)的鍵合相柱要求流動(dòng)相PH值在3-7之間,PH值(>8)的流動(dòng)相能溶解硅膠,使鍵合相流失。而目前利用較較先進(jìn)的雜化顆粒技術(shù)研制的高純硅膠顆粒填料,集硅膠和多孔聚合物填料的優(yōu)點(diǎn)為一體,使有機(jī)硅烷單元取代了相當(dāng)一部分占據(jù)顆粒內(nèi)部和表面位置的硅羥基,使這種新型填料具有分辨率高、穩(wěn)定性強(qiáng)、PH范圍寬(1-12)的優(yōu)勢(shì),其性能突破了傳統(tǒng)液相色譜柱的極限。所以一定要根據(jù)分析的對(duì)象、流動(dòng)相的條件選擇合適的分離柱,茫然時(shí)可向公司的技術(shù)人員咨詢。定期沖洗分離柱。每次分析工作結(jié)束時(shí),沖洗完緩沖鹽后,zui后要過度到用強(qiáng)溶劑沖洗柱子,如可用色譜純甲醇、乙腈沖洗反相C18柱,目的是沖去吸附在柱上的強(qiáng)保留組分。如果用甲醇/水為流動(dòng)相也應(yīng)這樣沖洗柱子,在一定程度上可恢復(fù)柱效。

3.2怎樣減少柱的污染?zui有效的辦法是純化樣品。我們?cè)诙嗄甑姆治龉ぷ髦邪l(fā)現(xiàn),凡是樣品純化的越干凈,分離柱的壽命就越長;反之,只有提取沒有純化的樣品,分離柱柱效下降較快。建立一個(gè)理想的色譜分析方法應(yīng)該有一套有效的樣品前處理方法,特別是在分析血漿和尿液樣品時(shí),要特別注意樣品的提取與純化,盡量使處理過的樣品中雜質(zhì)(如大分子蛋白、有機(jī)物等)降到zui低,保護(hù)柱頭和柱子。提取純化好的樣品用流動(dòng)相來溶解,一方面減少色譜圖中的溶劑峰干擾,另一方面也是檢查樣品在流動(dòng)相中的溶解性,如果樣品進(jìn)樣后在流動(dòng)相中沉淀,會(huì)堵塞進(jìn)樣器和柱頭,甚至樣品分解,出現(xiàn)怪峰。如果出現(xiàn)樣品與流動(dòng)相不溶要設(shè)法改變?nèi)芙鈼l件,如更換樣品溶劑,或改進(jìn)處理樣品的方法,或過濾,去除不溶性物質(zhì)。

4檢測器的常見故障及對(duì)策

液相色譜儀常用的檢測器主要有紫外、熒光和電化學(xué)檢測器。這些檢測器的作用就是收集流經(jīng)色譜分離柱的各組分在檢測器中的信號(hào),根據(jù)組分光吸收值/熒光強(qiáng)度/電極表面電流的變化計(jì)算出組分的濃度

[4]。各檢測器常見故障主要有:

4.1基線噪音較大和對(duì)策

對(duì)于紫外檢測器,氘燈光源打開后要預(yù)熱30分鐘以上,基線才能穩(wěn)定。氘燈用的過久,接近受命期時(shí)(氘燈的壽命約束1000小時(shí)),會(huì)使基線噪音明顯增加,應(yīng)及時(shí)更換氘燈。除光源外,流路中的氣泡也會(huì)產(chǎn)生噪音。怎樣判斷基線噪音增大是由于光源燈的老化還是來自流路中的氣泡?可將泵關(guān)上,繼續(xù)走基線,如果噪音立即停止,基線呈一條直線,說明基線噪音來自流動(dòng)相中的氣泡,應(yīng)設(shè)法排氣;若停泵后仍有噪音出現(xiàn),應(yīng)考慮是燈的問題。電化學(xué)檢測器中的工作電極(安培型)對(duì)氣泡十分敏感,儀器的平衡時(shí)間較長。流路中如果有氣泡存在,

不僅基線會(huì)出現(xiàn)尖峰,還會(huì)影響檢測。因此,做電化學(xué)檢測時(shí),流動(dòng)相的配制要很嚴(yán)格,水要超純、除還原物,配好后一定要過濾脫氣,還應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。如果泵系統(tǒng)不是PK材料,即電化學(xué)分析儀器,而是普通的液相色譜不銹鋼泵,應(yīng)對(duì)系統(tǒng)中的不銹鋼材料的輸液泵、進(jìn)樣器和管道,在分析前用6mol/L硝酸溶液鈍化(注意斷開分離柱),可縮短基線平衡時(shí)間。還可在流動(dòng)相中加入EDTA離子隱蔽劑,也是可以的。如果有較大的氣泡進(jìn)到檢測器中,光靠泵沖有時(shí)太慢,可暫時(shí)將泵停止,關(guān)上電化學(xué)檢測器,拆下工作電極,用超純水沖洗電極表面,也很奏效的,但對(duì)液相色譜技術(shù)不太熟練的技術(shù)員要小心操作,不宜反復(fù)這樣拆卸。

4.2檢測器污染及對(duì)策

管道污染阻塞是檢測器常見故障。當(dāng)流動(dòng)相用了緩沖鹽更換流動(dòng)相又不當(dāng)時(shí),常會(huì)在檢測器管路中產(chǎn)生沉淀,可先用5倍柱積的水沖洗,再用10倍柱積的強(qiáng)溶劑(如乙腈)流過,再用50倍的柱體積的異丙醇沖洗,zui后換上反相流動(dòng)相平衡。當(dāng)檢測器管路堵塞時(shí),可表現(xiàn)為柱壓升高,此時(shí),應(yīng)和柱頭堵塞相區(qū)分??蓴嚅_柱子,直接接檢測器,如泵壓仍較高,可判斷壓力升高是由于檢測器管道堵塞造成。檢測器進(jìn)口是常發(fā)生阻塞的地方,正向沖洗效果常不明顯,我們的經(jīng)驗(yàn)是將檢測器進(jìn)出口管道對(duì)調(diào),用6mol/L硝酸溶液反沖檢測器,能很快將阻塞沖開,但要注意用低流速?zèng)_洗,觀察壓力變化。檢測池阻塞和污染多見紫外檢測器。池阻塞也可用上述方法反沖,一般都能疏通。通常,池阻塞的故障比較少見,而池污染常發(fā)生,如不干凈的樣品在池窗上積聚等,都會(huì)造成檢測池污染。表現(xiàn)為基線噪音增大,儀器靈敏度下降??捎米⑸淦饕来嘶爻楫惐?、6mol/L硝酸,要小心操作,將池中的污物沖洗干凈,zui后用100ml純水正向沖洗檢測池。反向沖洗還可防止池滲漏。對(duì)于電化學(xué)檢測器,要注意維護(hù)工作電極表面的清潔度,當(dāng)檢測器檢測了大量較臟的樣品(如血漿、尿液)或用的過久,應(yīng)用化學(xué)法或物理拋光法對(duì)電極表面進(jìn)行清潔,可提高一定的檢測靈敏度,但要注意,zui后一定要用純水沖洗干凈,不要帶來其它污染。

我們僅就有限的篇幅談了一點(diǎn)從事液相色譜分析工作的經(jīng)驗(yàn),還有許多問題需要我們大家共同交流和探討。液相色譜儀是現(xiàn)代科學(xué)研究中廣泛使用的分析儀器,但我們必須學(xué)會(huì)正確的使用和維護(hù),才能更好的駕馭它,讓HPLC技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

液相色譜儀的幾個(gè)使用問題

1. 色譜柱中的流動(dòng)相會(huì)排干嗎?

不少做色譜分離試驗(yàn)的人遇到過這樣的情形:不慎未及時(shí)補(bǔ)充流動(dòng)相,泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干了,HPLC系統(tǒng)由此而停止工作了。如此情況是否會(huì)損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動(dòng)相都排干了?色譜柱還能使用嗎?事實(shí)上,如果泵將溶劑瓶中的流動(dòng)相吸干,并不會(huì)造成色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣,泵也不會(huì)將空氣排入色譜柱。因?yàn)楸弥荒茌斔鸵后w,而不能輸送空氣。相比之下,另一個(gè)更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而使色譜柱變干。同樣,整個(gè)色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生,多半可能只是色譜柱兩端的幾個(gè)毫米變干了,因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當(dāng)長的時(shí)間。即使色譜柱真的變干了,也不一定就不可救藥了??梢試L試用一種*脫氣的、表面張力低的溶劑(如經(jīng)氦氣脫氣的甲醇)沖洗色譜柱以除去氣體。

較低的表面張力有助于浸潤填料表面;已脫氣的溶劑應(yīng)該能夠溶解并去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)沖一個(gè)小時(shí)或更多的時(shí)間被*浸潤,恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2. 使用PEEK(polyetheretherketone)管路和接頭需要注意什么問題?

如果經(jīng)常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱,使用PEEK材料制成的管路和接頭會(huì)非常方便。PEEK管路容易連接;PEEK接頭不僅無需工具,手?jǐn)Q即可固定,而且容易調(diào)節(jié)錐箍之外的管路長度,方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。使用此類材料的管路需要注意的是:PEEK對(duì)鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解PEEK材料的明顯跡象,但PEEK遇到上述溶劑會(huì)變脆。另一個(gè)西藥考慮的因素是壓力限。不銹鋼管可耐受6000psi的壓力,但PEEK管只能耐受近4000psi(但多數(shù)HPLC應(yīng)用系統(tǒng)壓力不會(huì)超過3000psi)。使用PEEK接頭時(shí)則無需擔(dān)心接頭耐溶劑性能,因?yàn)榻宇^幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手?jǐn)Q固定的PEEK接頭壓力限低于不銹鋼管,因而壓力太高時(shí),可能會(huì)使接頭在管路上滑動(dòng)而產(chǎn)生死體積或漏液。

3. 如何預(yù)防液相泵的故障:
要保持泵的良好操作性能,必須維護(hù)系統(tǒng)的清潔保證溶劑和試劑的質(zhì)量對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行過濾和脫氣


下面列出預(yù)防泵故障的幾項(xiàng)措施: 

1).用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑;

2)、過濾流動(dòng)相和溶劑;

3)、脫氣;

4)、每天開始使用時(shí)放空排氣,工作結(jié)束后從泵中洗去緩沖液;

5)、不讓水或腐蝕

6)、定期更換墊圈;

7)、需要時(shí)加潤滑油;

8)、查閱有關(guān)泵操作手冊(cè)中的其它建議。
處于良好操作狀態(tài)的泵,應(yīng)該能使色譜圖上的基線平穩(wěn);保留時(shí)間的重復(fù)性好。在等度洗脫時(shí)壓力波動(dòng)小于2%。梯度洗脫時(shí)壓力變化應(yīng)是緩慢和平穩(wěn)的。為了使故障發(fā)生后盡快排除,平時(shí)應(yīng)常備密封、單向閥(入口與出口)、泵頭裝置、各式接頭、保險(xiǎn)絲等部件,以及更換工具。

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